CRISPR-Cas9文库技术原理及应用

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1、CRISPR-Cas9文库技术原理及应用 CRISPR-Cas9技术原理 CRISPR-Cas9技术依附着成本低廉,操作方便,效率高等优点,CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室,成为了生物科研的有力帮手,是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。 CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现,是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。CRISPR-Cas9系统由两部分组成,一部分是用来识别靶基因组的,长度为20bp左右的sgRNA序列,另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Ca

2、s9,能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割,最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复,从而形成基因的敲除和插入,最终实现基因的（定向）编辑。 与前两代技术相比,CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑,更重要的是可以同时对多个基因进行编辑,这也为全基因组筛选提供了有效的方法。目前比较常见的文库类型包括： l CRISPR-Cas9 knock out文库 l CRISPR panal文库 l CRISPRa/i文库 l psgRNA文库 CRISPR-Cas9文库建库流程 l 靶位点确

3、认及sgRNA文库设计 l sgRNA文库芯片合成 l sgRNA文库构建 l QC验证文库质量 l sgRNA文库慢病毒包装 l 感染稳定细胞株 l 药物筛选实验 l 细胞表型筛选 l NGS测序验证效用基因 CRISPR-Cas9文库应用方向 1、药物靶点确定与验证 CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中,通过大规模筛选技术,可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因,从而为疾病治疗提供相关数据。SCIENCE发表文章[1],研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选,最终发现NF2、CUL3等

4、4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。 2、基因环路上下游调控机制分析 CRISPR-Cas9文库筛选技术不仅可以用于编辑人类细胞蛋白编码基因,对于基因组中的调控元件也同样有效,利用这种方法可以对基因环路上游有调控机制进行分析。Nature biotechnology发表文章[2],科研人员利用CRISPR-Cas9文库对癌症细胞中关键的转录因子p53和ERα的增强子元件的685个基因位点进行筛查。通过CRISPR-Cas9文库筛选,共鉴定出3个增强元件与ERα的相关；3个增强元件与p53效用相关联的3个增强子,其中2个增强元件与p53完全结合才能激活细胞衰老过程。

5、 3、代谢通路调节机制分析 CRISPR-Cas9技术在植物代谢调控中也有相关成果。Plant Biotechnology Journal发表文章[3],科研人员选择对番茄植株GABA代谢通路中多个关键基因进行基因编辑,GABA作为人体中的抑制性神经递质,能调节人体免疫、血糖、血压,具有促进睡眠等效用,对人类健康有重要意义。通过得到六种GABA突变体(包含单基因突变、双基因突变、三基因突变、四基因突变),其中四基因突变的GABA-6突变体叶子GABA含量与WT相比提高了19倍,这为CRISPR-Cas9多靶点敲除技术在植株代谢调控中的应用研究提供了参考。 4、Long noncodin

6、g RNA作用机制分析 CRISPR-Cas9文库的建立可以实现基因组的大规模筛选,为了对非编码基因的效用进行验证,Nature biotechnology发表文章[4],提出构建了psgRNAs文库的方法,这种成对的sgRNA可在同一基因中造成两处断裂,形成大片段缺失,从而影响表型变化,成为研究非编码基因的重要方法。使用慢病毒psgRNA文库,对人源肝癌细胞系Huh7.5OC进行基因组的700个lncRNA和另外5种癌症细胞进行敲除实验,最终筛选到51个lncRNA基因能够促进或者抑制肿瘤的生长。 苏州泓迅科技利用独创的“GPS”（Genotype,Phenotype,Synotype）

7、平台,提供基于CRISPR-Cas9 sgRNA文库的一站式基因效用筛选服务。服务包括CRISPR-Cas9 sgRNA文库构建、慢病毒包装、高通量/高内涵筛选等,利用先进的合成及筛选技术平台,为客户提供基于CRISPR-Cas9技术的基因效用筛选全套解决方案。 参考文献 1. Shalem, O., et al., Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science, 2014. 343(6166): p. 84-7 2. Korkmaz, G., et al., Functional geneti

8、c screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016. 34(2): p. 192-8. 3. Li, R., et al., Multiplexed CRISPR/Cas9-mediated metabolic engineering of gamma-aminobutyric acid levels in Solanum lycopersicum. Plant Biotechnol J, 2017 4. Zhu, S., et al., Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library. Nat Biotechnol, 2016.34(12): p. 1279-1286. 知识改变命运 1 / 1