豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物的测定液相色谱-质谱质谱法

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ICS67.120.30 B 50 T/ZACA 团体标准 T/ZACA XXXXX—XXXX 豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物残留量测定液相色谱-质谱/质谱法 Determinationof residues of fluoroquinolones and nitroimidazoles in beansprout-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 浙江省质量合格评定协会发布 T/ZACA XXXXX—XXXX 目次 前言 II 1　范围 1 2　规范性引用文件 1 3　原理 1 4　试剂和材料 1 5　仪器 2 6　试样的制备与保存 2 7　分析步骤 2 8　精密度、灵敏度和准确度 5 附录A（资料性附录）　氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量 6 附录B（资料性附录）　氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20　μg/kg) 7 前言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由浙江省质量合格评定协会提出。 本标准由浙江省质量合格评定协会归口。 本标准主要起草单位：绿城农科检测技术有限公司、浙江省疾病预防控制中心。 本标准参与起草单位：浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、湖州市农畜水产品检测中心、丽水蓝城农科检测技术有限公司。 本标准主要起草人：余鹏飞、何晓明、章舒祺/徐小民、杨鲁琼、洪琳、倪娟桢、田佩琪、徐杰、沈东强、朱萌萌、周婷婷、卢军、陈志民、朱丽婷。 本标准为首次发布。 9 豆芽中氟喹诺酮和硝基咪唑类药物的测定液相色谱-质谱/质谱法 1　 范围 本标准规定了豆芽中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑含量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于豆芽中恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、洛美沙星、甲硝唑、二甲硝咪唑、异丙硝唑、洛硝哒唑含量的测定。 2　 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3　 原理 试样用1%乙酸乙腈提取，经均质提取、浓缩、正己烷净化、离心后，用液相色谱-串联质谱仪测定，用基质外标法定量。 4　 试剂和材料 除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。 4.1　 试剂 4.1.1　 乙腈：色谱纯。 4.1.2　 乙腈：分析纯。 4.1.3　 乙酸：分析纯。 4.1.4　 氯化钠：分析纯。 4.1.5　 甲醇：色谱纯。 4.1.6　 甲酸：色谱纯。 4.1.7　 甲酸铵：色谱纯。 4.1.8　 正己烷：色谱纯 4.2　 试剂配制 4.2.1　 1%乙酸乙腈：移取5 mL乙酸（4.1.3）和495 mL乙腈（4.1.2）混合。 4.2.2　 复溶液（0.1%甲酸30%甲醇水溶液）：300 mL甲醇（4.1.5）、1mL甲酸和699mL水混合。 4.3　 标准品 氟喹诺酮类8种、4种硝基咪唑类标准物质：纯度均大于等于90%（详见附录A） 4.4　 标准溶液配制 4.4.1　 标准储备溶液 标准储备液：准确称取适量每种氟喹诺酮和硝基咪唑类标准物质（4.3）于25.00mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混合均匀，转移至储液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期为6个月。 4.4.2　 标准中间液 标准中间液：分别准确移取每种标准储备液（4.4.1）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成10.0mg/mL的标准中间液，混合均匀，转移至储液瓶中，-18℃以下避光保存，有效期为3个月。 4.4.3　 混合标准工作液 分别准确移取每种1.00 mL标准中间液（4.4.2）于10.00mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1.00mg/mL混合均匀，转移至储液瓶中，4℃以下避光保存，有效期为7天。 4.4.4　 标准工作曲线 移取一定体积的混合标准工作液（4.4.3）用空白基质液分别配制成含4.00μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L、100μg/L、250μg/L、500 μg/L的8种氟喹诺酮类和4种硝基咪唑类标准工作溶液，浓度由低到高进样检测，以定量子离子的峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标，采用直线拟合的方式绘制标准工作曲线。实际检测中，经验证后可适当调整标准曲线的浓度范围。 5　 仪器 5.1　 液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾（ESI）离子源。 5.2　 高速组织捣碎机。 5.3　 分析天平，感量0.01g和0.00001g. 5.4　 氮吹仪。 5.5　 涡旋混匀器（2500 r/min）。 5.6　 离心机：转速≥12000 r/min。 5.7　 超声清洗仪。 5.8　 10mL试管。 5.9　 离心管：50 mL。 5.10　 容量瓶：25 mL。 5.11　 尼龙膜:0.22 μm。 6　 试样的制备与保存 取代表性豆芽样品约500 g，将其切碎后（不可用水洗），经高速组织捣碎机均匀捣碎，均分成两份，装入洁净容器内，密封，-18℃以下保存。 7　 分析步骤 7.1　 样品处理 称取5 g（精确至0.01g）试样，于50 mL离心管中，加入5mL水和10mL1%乙酸乙腈（4.2.1）均质1 min，超声提取20min，加入5g氯化钠（4.1.4）涡旋1min，12000 r/min离心3min，上层有机相转移到25 mL容量瓶中。残渣再用10 mL1%乙酸乙腈（4.2.1）重复提取一次，合并两次提取液，用1%乙酸乙腈（4.2.1）定容到25mL，混合均匀，准确移取10mL提取液于10mL试管中，40℃氮吹至近干。加入1mL复溶液（4.2.2），超声3min、涡旋3min，溶解残渣，再加入1 mL正己烷，涡旋30s，12000 r/min离心3min，取下层清液过0.22 μm尼龙膜于样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定。 7.2　 测定 7.2.1　 液相色谱条件 7.2.1.1　 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3，2.1100mm（i.d.），1.8 m，或性能相当者。 7.2.1.2　 进样量：5μL。 7.2.1.3　 流速为：0.35mL/min。 7.2.1.4　 柱温：35℃ 7.2.1.5　 流动相：A为0.1%甲酸2 mmol甲酸铵水溶液；B为0.1%甲酸乙腈。梯度洗脱条件见表1。 表1　 梯度洗脱程序 时间/min 流速/（mL/min） 流动相A/（%） 流动相B/（%） 0.00 0.35 93 7 0.50 0.35 93 7 3.00 0.35 75 25 4.50 0.35 5 95 5.00 0.35 5 95 5.01 0.35 93 7 7.00 0.35 93 7 7.3　 质谱条件 7.3.1　 离子源为电喷雾离子源（ESI）。 7.3.2　 扫描方式为正离子扫描。 7.3.3　 检测方式为多反应监测。 7.3.4　 干燥气流量：8.0L/min。 7.3.5　 加热气流量：10L/min。 7.3.6　 接口温度：300℃。 7.3.7　 雾化气流量：2.8L/min。 7.3.8　 DL管温度：250℃。 7.3.9　 加热块温度：400℃。 7.3.10　 毛细管电压：4000V。 7.3.11　 定性离子对、定量离子对、碰撞能量（CE）和偏转电压（Q1、Q3）见表2。 表2　 多反应监测条件 被测物名称 参考保留时间/min 母离子（m/z） 子离子（m/z） Q1电压/V CE Q3电压/V 恩诺沙星 4.36 360.20 316.20* -13.0 -19.0 -15.0 342.20 -13.0 -21.0 -16.0 诺氟沙星 4.02 320.20 302.15* -12.0 -20.0 -22.0 231.05 -12.0 -38.0 -25.0 培氟沙星 4.08 334.20 316.15* -26.0 -21.0 -22.0 290.15 -26.0 -18.0 -14.0 环丙沙星 4.10 332.20 314.15* -23.0 -20.0 -23.0 231.10 -23.0 -37.0 -25.0 氧氟沙星 4.05 362.20 318.20* -14.0 -19.0 -21.0 261.15 -14.0 -27.0 -13.0 沙拉沙星 4.48 386.20 368.05* -14.0 -23.0 -26.0 342.10 -14.0 -19.0 -24.0 洛美沙星 4.26 352.20 265.10* -27.0 -23.0 -12.0 308.20 -27.0 -16.0 -21.0 达氟沙星 4.26 358.20 340.15* -30.0 -30.0 -30.0 82.10 -30.0 -50.0 -29.0 甲硝唑 2.94 172.10 128.10* -22.0 -13.0 -24.0 82.15 -22.0 -25.0 -29.0 二甲硝咪唑 3.46 142.10 96.15* -10.0 -17.0 -18.0 81.15 -10.0 -25.0 -30.0 洛硝哒唑 3.31 201.10 140.10* -14.0 -14.0 -14.0 55.20 -14.0 -23.0 -24.0 异丙硝唑 4.80 170.10 109.15* -21.0 -25.0 -22.0 124.20 -21.0 -21.0 -23.0 注： 带“*”的离子为定量离子；对于不同质谱仪，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。 7.4　 液相色谱-串联质谱测定 7.4.1　 定量测定 采用基质加标单点法或者基质标准工作曲线法定量。根据试样中被测组分的含量，选取响应值适宜的标准工作液进行分析。标准工作溶液和待测样液中8种氟喹诺酮和4种硝基咪唑的响应均在方法的线性响应范围内。如果含量超过标准曲线范围，可调整取样量、定容体积，重新处理样品后进行测定。在上述色谱条件下，参考保留时间参见表2；标准溶液多反应监测色谱图见附录B中B.1。 7.4.2　 定性测定 在相同的实验条件下，样液中被测物的色谱峰保留时间与标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在2.5%之内；并且在扣除背景后的样液图谱中，所选的离子对均出现，各定性离子的相对丰度与标准品离子的相对丰度相比，偏差不超过表3规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表3　 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% ≥50 ＞20至50 ＞10至20 ≤10 允许的相对偏差/% 20 25 30 50 7.4.3　 空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 7.4.4　 结果计算和表述 试样中被测组分含量按式（1）计算，计算结果保留三位有效数字。 X=CV1000m10001025 …………………………………………（1） 式中： X——试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（mg/kg）； c——标准曲线计算出的试样上机液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V——试样的定容体积，单位为毫升（mL）; m——试样的质量，单位为克（g）。 8　 精密度、灵敏度和准确度 8.1　 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。 8.2　 灵敏度 本方法定量限为2.0 μg/kg。 8.3　 准确度 本方法中被测组分的添加浓度在2.00mg/kg~250mg/kg时，回收率为70.0%~120%。 A A 附　录　A （资料性附录） 氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量 表A.1　 氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物中英文名称、CAS号、分子式和相对分子质量 序号 中文名称 英文名称 CAS号 分子式 相对分子质量 1 恩诺沙星 Enrofloxacin 93106-60-6 C19H22FN3O3 359.4 2 诺氟沙星 Norfloxacin 70458-96-7 C16H18FN3O3 319.3 3 培氟沙星二水甲磺酸盐 Pefloxacin mesylate 70458-95-6 C18H24FN3O6S 429.5 4 环丙沙星 Ciprofloxacin 85721-33-1 C17H18FN3O3 331.3 5 洛美沙星 Lomefloxacin 98079-51-7 C17H20ClF2N3O3 387.8 6 氧氟沙星 Ofloxacin 82419-36-1 C18H20FN3O4 361.4 7 盐酸沙拉沙星 Sarafloxacin Hydrochloride 91296-87-6 C20H18ClF2N3O3 421.8 8 甲磺酸达氟沙星 Danofloxacin Mesylate 119478-55-6 C20H24FN3O6S 453.5 9 甲硝唑 metronidazole 443-48-1 C6H9N3O3 171.2 10 二甲硝咪唑 Dimetridazol 551-92-8 C5H7N3O2 141.1 11 异丙硝唑 Ipronidazole 14885-29-1 C7H11N3O2 169.2 12 洛硝哒唑 Ronidazole .7681-76-7 C6H8N4O4 200.1 B B 附　录　B （资料性附录） 氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20 μg/kg) 表B.1氟喹诺酮类及硝基咪唑类药物混合标准溶液选择离子流图(20 μg/kg) a) 甲硝唑 b）二甲硝咪唑 c)异丙硝唑 d）洛硝哒唑 e）诺氟沙星 f）氧氟沙星 g）培氟沙星 h）环丙沙星 i）洛美沙星 j）沙拉沙星 k）达氟沙星 l）恩诺沙星 _________________________________